TIPS FÜR ANFÄNGER

Bakterien untersucht - nichts gesehen ...
Wassertropfen untersucht - auch nichts gesehen ...
Stengelscheibe druntergelegt - alles schwarz ...
Fleisch fein gehackt - Schmierkram ...
Zu färben versucht - Teppich versaut - böser Schweinkram ...
Mehl mit Wasser verrührt - na ja ...

Ergebnis: "Man sieht zwar nichts, aber das ganz stark vergrößert - toll!"

 

Ansprechpartner für alle Fragen:

Herr Matthias Burba

matthiasburba@hotmail.com

 

Was untersuche ich?

Als Anfänger sollte man nur solche Objekte bearbeiten, die leicht zu beschaffen sind, eine große Formenvielfalt besitzen und die man ohne mikrotechnische Vorbehandlung untersuchen kann. Wir empfehlen daher, sich zunächst mit Plankton zu beschäftigen! Allerdings genügt es nicht, einfach einen Tropfen Teichwasser unters Mikroskop zu bringen, denn die Planktonkonzentration ist viel zu gering. Man benötigt vielmehr ein Planktonnetz, das man wahlweise an einem Stock oder an einer geflochtenen Perlonschnur befestigen kann - es ist dann auch möglich, Proben von Brücken oder Kaimauern aus zu nehmen. Die Proben werden in kleinen Gläschen aufbewahrt, die man nur zu zwei Dritteln füllt, damit eine gewisse Sauerstoffreserve vorhanden ist. Diese Gläschen transportiert man in einer Thermobox, wie man sie für Picknicks benutzt, da Plankton gegen Temperaturänderungen recht empfindlich ist. Am besten füllt man die Box mit einigen Litern Wasser der ersten Probeentnahmestelle, um die Temperatur konstant zu halten.

Zur Untersuchung benötigt man lediglich Objektträger, Deckgläschen und einige Pipetten, denn Plankton sollte man immer lebend untersuchen. Nach einigen Stunden versetzt man die Probe mit Formalin (1 ml Formalin 40%ig pro 10 ml), um sie zu konservieren. Pflanzliches Plankton bleibt hierbei erhalten, ferner tierisches Plankton, sofern die Arten einen Panzer besitzen. Eine wirklich zufriedenstellende Konservierungsmethode für Plankton gibt es nicht. Es empfiehlt sich, der konservierten Probe noch einige Tropfen Glycerin zuzusetzen, denn falls die Probe im Laufe der Zeit eintrocknet, bleibt am Boden eine Glycerinschicht erhalten, die man einfach mit Wasser wieder verdünnen kann. Ohne Glycerin ist eine eingetrocknete Planktonprobe nicht mehr zu retten.

Alle benötigten Geräte (und Chemikalien) erhält man in Fachhandlungen für Schulbedarf (Lehrmittelhandlungen).

Die Formenfülle von Süß- und Salzwasserplankton ist außerordentlich groß, und als Anfänger ist es anfangs unmöglich, die Lebewesen auch nur annähernd einzuordnen. Hier helfen einführende Bücher:

  DAS LEBEN IM WASSERTROPFEN ISBN 3-440-04000-3
  MARINES PHYTOPLANKTON ISBN 3-13-503901-3
  DAS GROSSE KOSMOS-BUCH DER MIKROSKOPIE ISBN 3-440-08989-4

 

Welches Mikroskop kaufe ich?

Wenn man sich nur orientieren will, ob Mikroskopie das geeignete Hobby ist, sollte man sich mit einem billigen Schulmikroskop begnügen. Derartige Geräte sind für etwa EUR 150 - 250 zu haben. Wichtig ist eine eingebaute Beleuchtung mit Dimmer und ein monokularer Schrägeinblick (beides ist heute Standard!). Außerdem sollte ein Objektführer vorhanden sein. Um eine Digitalkamera anbringen zu können, kaufe man zusätzlich für wenig Geld einen passenden Gradeinblick.

Will man sich ersthaft mit Mikroskopie beschäftigen, benötigt man ein Gerät, mit dem man ermüdungsfrei arbeiten kann. Wichtig sind nicht (!) Hochleistungsobjektive, sondern gute Okulare und ein binokularer Schrägeinblick - besser noch ein (teurer) trinokularer Schrägeinblick, so daß stets eine Kamera verfügbar ist. Viele Digitalkameras lassen sich auch im Aufnahmemodus an ein TV-Gerät anschließen und auf diese Weise als TV-Kamera "mißbrauchen", so daß die ganze Familie angesprochen werden kann.

Als Okulare verwendet man 15-fach "Weitfeld-Okulare". Für Brillenträger gibt es spezielle "Brillenokulare" - hier ist folgendes zu bedenken: Erledigt man die Arbeiten neben dem Mikroskop (Anfertigen von Präparaten, Beschriften u.s.w.) ohne Brille, wie dies bei kurzsichtigen Personen üblich ist, sind Brillenokulare von Nachteil, denn man muß dann beim Blick ins Mikroskop jedesmal erneut die Brille aufsetzen. Arbeitet man dagegen mit einer Lesebrille, wie dies Weitsichtige tun, sind Brillenokulare sehr empfehlenswert. Liegt eine starke Hornhautverkrümmung vor (zylindrische Brillengläser!) sind Brillenokulare unumgänglich, da Okulare naturgemäß eine Hornhautverkrümmung nicht ausgleichen können. Für Gleitsichtbrillen sind Brillenokulare unbrauchbar.

Als Objektive wählt man "Planachromate"; günstig ist die Kombination 5x, 20x, 40x und 60x. Am häufigsten arbeitet man erfahrungsgemäß mit den Objektiven 20x und 40x. Ein 100x Ölimmersionsobjektiv wird so gut wie nie gebraucht, sündhaft teure Hochleistungsobjektive (z.B. Apochromate) sind sinnlos, da ihre Eigenschaften bei den üblichen Präparaten gar nicht zur Geltung kommen - ihre geringere Tiefenschärfe ist dann sogar von Nachteil. Entscheidend ist, daß das Bildfeld nicht nur randscharf ist, sondern auch keine Wölbung zeigt. Eine Bildfeldwölbung fällt sofort auf, wenn man das Präparat verschiebt. Ist das Bildfeld gewölbt, wird man bei längerem Arbeiten leicht "Seekrank".

Wichtig ist ferner, daß der Kondensor auf die Objektive abgestimmt ist. Seine "Numerische Apertur" (N.A.) muß mit der höchsten Numerischen Apertur der Objektive übereinstimmen, sonst werden hochauflösende Objektive nicht genutzt. Man verwendet einen Klapplinsenkondensor, der mit Hilfe eines Zahntriebes höhenverstellbar sein muß. Wenn möglich, sollte er zentrierbar sein.

Ein Objektführer ist unbedingt zu empfehlen, besser noch ein "Kreuztisch". In jedem Falle sollten die Bedienungsrädchen nach unten zeigen, weil dies bei längerem Arbeiten weniger ermüdend ist.

Das beigefügte Bild eines entsprechenden Mikroskopes veranschaulicht die kritischen Details.

Damit stellt sich die Frage nach der Marke des teureren Gerätes. Die von Lehrmittelhandlungen angebotenen leistungsfähigeren Mikroskope - oft in Ostasien gefertigt und dann mit Fantasiemarkennamen geschmückt - besitzen gewöhnlich ein recht gutes Preis-Leistungs-Verhältnis. Es ist jedoch fraglich, ob man derartige Geräte auch in fünf bis zehn Jahren noch nachrüsten kann (z.B. mit einer Phasenkontrasteinrichtung). Bei Markenmikroskopen (ZEISS, LEITZ, OLYMPUS, um nur einige zu nennen) ist dies mit Sicherheit möglich, und sei es über ein Angebot bei Ebay - aber Markengeräte sind eben entsprechend teuer!

Hier noch zwei Hinweise:

1. Man achte darauf, daß die Frontlinse der Objektive (abgesehen von Lupenvergrößerung) frei zugänglich (s.Grafik, A) und nicht versenkt ist (Grafik, B, billigere Bauweise) - andernfalls sind Verunreinigungen der Frontlinse nur sehr schwer zu entfernen!

2. Die Handrädchen von Feintrieben sind bei billigen Mikroskopen oft zwar formschön, jedoch unzureichend befestigt! Man prüft, indem man beide Rädchen (links und rechts) kräftig gegen den Uhrzeigersinn gegeneinander zu drehen versucht, so als wolle man die Rädchen abschrauben. Bei schlecht verarbeiteten oder falsch konstruierten Feintrieben lösen sich dann diese Bedienungselemente und sind oft nur mit großem Aufwand wieder zu befestigen. Bei guter Verarbeitung ist ein solches Verdrehen unmöglich!

 

Ein paar Worte zur sinnvollen Vergrößerung

Anfänger betrachten ein Mikroskop leider oft als ein Gerät, das möglichst stark vergrößern soll - deshalb sind Bakterien bei Anfängern ganz besonders beliebte Objekte. Entscheidend ist jedoch nicht die Vergrößerung, sondern die Auflösung der Optik. Man versteht unter der Auflösung d denjenigen minimalen Abstand, den zwei Punkte gerade noch haben dürfen, um im Mikroskop getrennt gesehen zu werden. Näherungsweise gilt:

  Auflösung = Wellenlänge / Numerische Apertur d = lmd / NA

Setzt man für die Wellenlänge lmd die Wellenlänge des grünen Lichtes ein (0,55 um) und für die Numerische Apertur (NA) den Wert 0,1 (schwaches Objektiv) bzw. 1,33 (stäkstes Objektiv), so beträgt die Auflösung im ersten Fall 5,5 um, im zweiten Fall 0,4 um. Noch feinere Strukturen werden nicht aufgelöst, sie erscheinen auch bei stäkster Vergrößerung homogen, also strukturlos. Zugleich gibt der NA-Wert, der auf jedem Objektiv angegeben ist, die stärkste sinnvolle Vergrößerung an, die mit dem betreffenden Objektiv erreichbar ist - sie liegt bei der 1000-fachen NA. Ein schwaches Objektiv läßt somit lediglich eine "förderliche Vergrößerung" von 100-fach zu, ein sehrt starkes Objektiv eine "förderliche Vergrößerung" von 1300-fach. Erhöht man die Vergrößerung weiter, indem man stark vergrößernde Okulare anwendet, kommt man in den Bereich der "leeren Vergrößerung" - das Bild wird zwar größer, zeigt jedoch keine neuen Einzelheiten.

Streng genommen lautet die Formel d = f . lmd / NA. Siehe hierzu die beigefügte Grafik. Setzt man den Faktor f gleich 1, resultiert die obige vereinfachte Formel; gewöhnlich rechnet man mit f = 0,6.

Leider wird die "Abbesche Formel" oft auch von Profis mißdeutet. Man muß nämlich zwischen "Grenzauflösung", "Strukturauflösung" und "Bildauflösung" unterscheiden! Stellen wir uns zwei feine Raster aus runden bzw. quadratischen Punkten vor, jeweils mit einem Punktabstand von 0,4 um. Bei stärkster Vergrößerung (NA = 1,33) sieht man im Mikroskop zwei unterschiedliche Strukturen, jedoch ist es unmöglich, verläßliche Aussagen über die Form der Rasterelemente zu machen - das Mikroskop liefert lediglich zwei unterschiedliche "Äquivalentbilder". Dies zeigt das folgende Bildpaar sehr deutlich: Links der Panzer einer Kieselage (Gyrosima sp.) im lichtmikroskopischen Bild - "deutlich" erkennt man ein sich rechtwinklig kreuzendes Liniensystem; rechts dieselbe Alge, aufgenommen mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) bei ähnlicher Vergrößerung - nun erkennt man, daß es sich bei der Struktur tatsächlich um regelmäßig angeordnete runde Poren handelt, denn die Auflösung des REM ist wesentlich höher!

 

Man sollte daher stets bedenken, daß die Abbesche Formel die "Grenzauflösung" liefert. Um eine Struktur deuten zu können, muß die Struktur mindestens 5-mal gröber sein: Erst ab 2 um, besser ab 5 um gibt das lichtmikroskopische Bild Strukturen realistisch und damit deutbar wieder, erst ab 2 um bis 5 um ist man im Bereich der "Strukturauflösung"! Ferner ist zu bedenken, daß ein "Bild" aus mehreren "Strukturen" besteht - der Bereich der "Bildauflösung" beginnt somit im Bereich von 10 um bis 50 um. Nun wird verständlich, weshalb Bakterien (Durchmesser um 1 um) für Amateure denkbar ungünstige Objekte sind: Sie liegen noch im Bereich der "Grenzauflösung"!

Zur Artbestimmung greift man auch heute noch oft auf "Äquivalentbilder" zurück, weshalb Spezialisten Feinststrukturen mit höchster Auflösung untersuchen; als Amateur, erst recht als Anfänger, ist man jedoch darauf angewiesen, mikroskopische Bilder deuten zu können, und daher sollte man sich mit Objekten beschäftigen, deren Durchmesser 10 um nicht unterschreitet.

 

Der Kondensor, das unbekannte Wesen ...

Wohl mit keinem Bauteil des Mikroskopes wird soviel Unheil angerichtet wie mit dem Kondensor (auch "Abbescher Beleuchtungsapparat" genannt) - man könnte ihn geradezu als "Bildverschlechterungseinheit" bezeichnen, obwohl der Kondensor, richtig bedient, die Bildqualität erheblich erhöht. Die Funktionsweise des Kondensors zeigt die folgende Grafik. Die grünen Strahlen markieren den Öffnungswinkel des Objektives, und es gilt: NA = n x 2sin(a) mit n = 1 (Luft). Je kleiner der Winkel, desto niedriger die Numerische Apertur NA und somit die Auflösung des Objektives. Der Kondensor soll nun sicherstellen, daß der Öffnungswinkel des Objektives auch tatsächlich ausgenutzt wird, und dies ist nur dann der Fall, wenn sich die obere Linse des Kondensors dicht unter dem Präparat befindet und die Blende des Kondensors - die Aperturblende - ganz geöffnet ist. Dreht man den Kondensor nach unten oder schließt man die Aperturblende, so ist die tatsächliche Apertur des Kondensors und folglich des Objektives geringer und die Auflösung sinkt entsprechend.

Für den Anfänger gilt:

Kondensor ganz nach oben drehen und Aperturblende zunächst mindestens halb öffnen. Insbesondere darf man die Lichthelligkeit keines Falles mit der Aperturblende schwächen! Hierzu dienen entweder Grauscheiben oder ein Dimmer (heute auch in billigen Mikroskopen vorhanden).

In der Praxis wird man mit etwa halb geöffneter Aperturblende arbeiten, zum einen, um Überstrahlungen zu vermeiden, zum anderen, um die Tiefenschärfe zu erhöhen. Außerdem sollte die tatsächliche Apertur des Kondensors die Apertur des Objektives nicht überschreiten.

Es ist sehr instruktiv, sich ein fein strukturiertes Objekt, z.B. einen Kieselalgenpanzer, bei starker Vergrößerung anzuschauen und dann die Aperturblende langsam zu schließen: Das Bild erscheint zunehmend kontrastreicher und "schärfer", allerdings treten nur die gröberen Strukturen deutlicher hervor, während die feineren Strukturen verschwimmen oder sogar ganz verschwinden.

Man stellt nun bald fest, daß sich die obige Regel bei starken Objektiven gar nicht anwenden läßt, denn je stärker das Objektiv, desto geringer die Tiefenschärfe und damit leider auch die Bildüberstrahlung durch diejenigen Schichten des Präparates, die nicht scharf abgebildet werden. Um auch diese "Störenfriede" mit "ins Boot" zu holen, bleibt gar nichts anderes übrig, als die Aperturblende zu schließen (s.Grafik). Dies hat jedoch sehr nachteilige Folgen für die Bildqualität: Die abgebildete Optik mit einer NA von 0,3 läßt eine förderliche Vergrößerung von 300-fach zu - wenn es sich um ein 20-fach Objektiv handelt und man mit einem 15-fach Okular arbeitet, beträgt die Vergrößerung 20 x 15 = 300-fach, und man liegt noch im Bereich der förderlichen Vergrößerung. Arbeitet man nun statt dessen mit einem 60-fach Objektiv (s.Grafik), muß jedoch stark abblenden, so ist die tatsächliche (!) NA auf ca. 0,2 gesunken und die Grenze der förderlichen Vergrößerung sinkt entsprechend auf 200-fach - man arbeitet jedoch bei einer Vergrößerung von 60 x 15 = 900-fach, also weit jenseits der förderlichen Vergrößerung. Bei schwachen Objektiven ist dies nicht schlimm, bei starken Objektiven nimmt dann die Bildqualität jedoch ganz erheblich ab! Dies alles führt zu der folgenden Regel, die leider oft auch von Profis nicht beherzigt wird:

Ist man gezwungen, mit weitgehend geschlossener Aperturblende zu arbeiten, so ist das gewählte Objektiv zu stark für das betreffende Präparat und man muß ein schwächeres Objektiv wählen oder für ein dünneres Präparat sorgen!

Man versteht nun, weshalb schon 60-fach Objektive nur selten mit Gewinn eingesetzt werden können, und das gilt erst recht für 100-fach Objektive!

Hochwertige Mikroskope besitzen im Fuß noch eine weitere Blende, die "Leuchtfeldblende". Ist eine solche Blende vorhanden, geht man folgendermaßen vor: Präparat scharf stellen und Leuchtfeldblende schließen, dann Kondensor soweit senken, bis die Ränder der Leuchtfeldblende scharf im Blickfeld erscheinen; nun Leuchtfeldblende soweit öffnen, daß die Ränder gerade aus dem Blickfeld verschwinden. Für die Aperturblende gilt das oben Gesagte. Wie man sieht, dient auch die Leuchtfeldblende nicht der Lichtschwächung, die hier geschilderte Einstellung soll vielmehr unerwünschte Reflexe und Überstrahlungen unterdrücken, zugleich verbessert sie die Bildhellikeit (wichtig bei Mikrofotografie). Da das hier beschriebene Verfahren nur mit einem gut zentrierten Kondensor gelingt, sind zentrierbare Kondensoren von großem Vorteil.

 

Die Beschriftung der Objektive

Auf Objektiven findet man gewöhnlich die folgenden Angaben:

1. Hersteller

2. Bautyp (Achromat, Planachromat, Apochromat, Neofluar, Fluorit u.a)

Achromatische Objektive sind rot-blau-korrigiert. Dies ist ein Kompromiß, um Farbränder einigermaßen zu unterdrücken - der für Anfänger ausreichende Typ.

Planachromate besitzen zusätzlich ein ebenes und besonders randscharfes Bild - bei längerem Arbeiten sehr von Vorteil.

Apochromate sind für alle Farben korrigiert und dem entsprechend extrem teuer. Derartige Objektive zeigen ihre Qualität nur bei geeigneten Objekten und hoher Auflösung - für Anfänger ist die Anschaffung unsinnig.

3. NA ( Numerische Apertur ). Gibt indirekt die maximal erreichbare Auflösung an (s.o.).

4. Vergrößerung (z.B. 20x).

Die Gesamtvergrößerung GV errechnet sich aus der Objetivvergrößerung OB und der Okularvergrößerung OK (s.Grafik). Man beachte, daß beim Schließen der Kondensorblende die Gesamtvergrößerung GV trotz Verschlechterung des Bildqualität erhalten bleibt. Im Idealfall sollte gelten:

GV = OB x OK = 1000 x NA

Bei schwachen Objektiven stört es nicht, wenn man oberhalb der förderlichen Vergrößerung arbeitet (also GV > 1000 x NA), bei starken Objektiven sollte man dies jedoch vermeiden, da dann die Bildqualität erheblich sinkt.

5. Tubuslänge (160 mm, 170 mm, oo).

Bei der Berechnung der Objektive wird eine definierte Tubuslänge zugrunde gelegt (gewöhnlich 170 mm, 160 mm bei der Firma ZEISS, heute sehr oft "unendlich" oo). Solange man alle Teile des Mikroskopes aus einer Hand erwirbt, braucht man sich über die Tubuslänge keine Gedanken zu machen, kombiniert man dagegen Bauteile verschiedener Hersteller, ist auf die Tubuslänge zu achten! Dies gilt insbesondere für hochauflösende Objektive - ein "Schnäppchen" bei Ebay, in das falsche Mikroskop eingesetzt, ist oft eine Enttäuschung! Überhaupt sollte man als Anfänger von einer Kombination von Optiken unterschiedlicher Hersteller absehen, denn man erhält leider stets scheinbar brauchbare Ergebnisse - den tatsächlichen Qualitätsverlust kann man als Anfänger wegen mangelnder Vergleichsmöglichkeiten gar nicht abschätzen.

Beim Nachkauf von Objektiven ist unbedingt darauf zu achten, daß Objektive, die auf "unendlich" berechnet sind ("oo"), nur in einem dafür ausgelegten Mikroskop Bilder liefern (derartige Mikroskope verfügen im Tubus über eine zusätzliche Hilfslinse).

6. Deckglasdicke (z.B. /0.17 mm)

Bei höherwertigen Objektiven ist oft noch die optimale Deckglasdicke angegeben.

7. ...und was nicht auf dem Objektiv steht:

Objektive sind Mehrlinsensysteme, wobei jede Linsenfläche einen kleinen Teil des Lichtes reflektiert. Dieses Licht "vagabundiert" dann innerhalb des Objektives umher und führt letztlich dazu, daß das Bild kontrastärmer wird und daß Färbungen weniger brillant aussehen. Um dies weitgehend zu vermeiden, werden alle Linsen "vergütet", d.h., sie werden mit einer hauchdünnen Spezialschicht bedampft, welche diese unerwünschte Reflektion stark herabsetzt; außerdem verwendet man bei Kombilinsen speziell angepaßte Linsenkitte. Zwei optisch identische Objektive (gleiche Vergrößerung, gleiche N.A., gleicher Korrekturtyp) können sich daher in ihrer Leistunsfähigkeit ganz erheblich unterscheiden! Dies ist beim Kauf "preiswerter" Mikroskope zu bedenken! Man sollte sich vor dem Kauf das Gerät vorführen lassen, wobei man ein brillant gefärbtes Präparat einlegt und sich dasselbe einmal durch die Standardoptik, zum anderen durch ein ausgeliehenes ZEISS- oder LEITZ-Objektiv derselben Vergrößerung anschaut. Eventuell muß man einen Kompromiß schließen: Preiswertes Gerät plus teurere Markenoptik.

Und so arbeitet man

Grundsätzlich gilt: Niemals ohne Deckglas mikroskopieren! Ein Decklas schont nicht nur die Frontlinse des Objektives, es ist vielmehr Teil des Objektives, denn bei der Berechnung von Objektiven geht man stets von Deckgläschen aus, die eine Dicke von 0,18 mm besitzen - schon abweichende Dicken machen sich bei hohen Aperturen störend bemerkbar.

Aber auch bei vorsichtigem Arbeiten verschmutzen die Frontlinsen der Objektive. Man schraubt die Objektive daher von Zeit zu Zeit aus dem Revolver und hält sie dann so, daß sich eine Lichtquelle in der Frontlinse spiegelt. Verschmutzungen sind dann gut zu erkennen. Man entfernt sie mit Wasser und Küchenflies. Fette werden mit Waschbenzin entfernt. Alkohol und Aceton dürfen nicht verwendet werden, da diese Lösungsmittel in die Optik eindringen und den Linsenkitt zerstören können. Oft ist eine schlechte Bildqualität eine Folge von Frontlinsenverschmutzung, wobei eine solche Verschmutzung gewöhnlich zu einer "schleichenden" Abnahme des Bildkontrastes führt, die dem Anfänger gar nicht auffällt.

Liegt das Präparat erst einmal unter dem Mikroskop ist es wichtig, stets beide Hände am Mikroskop zu haben: Mit der einen Hand dreht man am Feintrieb, mit der anderen verändert man die Öffnung der Aperturblende oder bewegt das Präparat mit dem Objektführer weiter (deshalb ist es wünschenswert, daß dessen Bedienungsrädchen nach unten zeigen). An diesen ständigen Handbewegungen erkennt man den geübten Mikroskopiker - wer nur "in die Röhre guckt" und dabei die Hände in den Schoß legt, muß noch viel üben!

Schließlich noch ein weiterer guter Rat: Es gibt in Deutschland zahlreiche Gruppen, die sich mit Mikroskopie beschäftigen - diese Gruppen stehen Gästen, Anfängern und fortgeschrittenen Amateuren stets offen, nehmen Sie Kontakt auf, besuchen Sie deren Veranstaltungen und holen Sie sich dort Anregungen, Rat und Hilfe. Eine entsprechende Liste ist über den Button <LINKS> zugänglich.

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